質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)中一個(gè)基本而簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)。你不 不需要使用你的大腦，只需按照提取工具包中的說(shuō)明來(lái)解釋這個(gè)傻瓜 s操作（事實(shí)上，這些簡(jiǎn)單但耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該由實(shí)驗(yàn)室里的機(jī)器人來(lái)操作）雖然操作簡(jiǎn)單，但是質(zhì)粒提取也是重要的一步質(zhì)粒提取的質(zhì)量和數(shù)量將直接決定后續(xù)實(shí)驗(yàn)室的成敗。當(dāng)我們按照套件中的說(shuō)明操作時(shí)，我們會(huì)看到不同的解決方案，如P1P2N3PE和EB（不同的試劑盒可能有不同的標(biāo)簽）那么你知道每瓶溶液里是什么嗎？它們?cè)谫|(zhì)粒提取中的作用是什么？

通過(guò)堿裂解提取質(zhì)粒（Alkali decomposition）所以讓我們 讓我們看看P1P2N3PE和EB的解決方案是什么。

溶液1（P1）

成分濃度25mMTris-HCl（pH8.50mM葡萄糖，50mM葡萄糖（Glucose）

溶液1的主要功能是懸浮細(xì)菌沉淀。25 million tons-HCl是一種緩沖溶液，用于確保反應(yīng)系統(tǒng)的恒定pH值。EDTA是金屬離子的螯合劑，10mMEDTA的作用是與微生物中的金屬離子結(jié)合，抑制DNA酶的活性。50mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保證細(xì)菌的懸浮，延緩細(xì)菌的沉降時(shí)間。Rnase通常在使用前加入溶液1中（RNaseA）核糖核酸酶的作用非常明確，降解溶液中的RNA。由于核糖核酸酶屬于蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性很差，所以加入核糖核酸酶的溶液1需要在4℃的低溫下保存。

溶液2（P2）

成分濃度250mMNaOH，1％W/V）SDS（十二烷基硫酸鈉）

溶液2的主要功能是細(xì)胞溶解。溶液1懸浮細(xì)胞后，需要加入溶液2，其作用是溶解細(xì)胞。解決方案2僅包括兩個(gè)組件：氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉。真正在細(xì)胞裂解中起作用的是氫氧化鈉，這也是為什么這種方法叫堿裂解。氫氧化鈉會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其雙層化（雙層膜）結(jié)構(gòu)取向，膠束（微囊）結(jié)構(gòu)的相變，導(dǎo)致細(xì)胞溶解。SDS的作用將在下一步提到。加入溶液2后需要注意的一點(diǎn)是時(shí)間一定不能太長(zhǎng)，二是離心管不能劇烈晃動(dòng)。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和劇烈振動(dòng)會(huì)使氫氧化鈉破壞基因組DNA，破碎的基因組DNA片段會(huì)和大小相近的質(zhì)粒一起被提取出來(lái)，污染樣品。

溶液3（N3）

成分濃度3M醋酸鉀（potassium acetate），5M醋酸

溶液3的主要作用是中和第二步中加入的強(qiáng)堿，去除細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。Common is the abbreviation of neutralization。堿性溶液中的氫氧化鈉會(huì)長(zhǎng)期破壞其與DNA基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)，所以需要中和。要中和氫氧化鈉，5M醋酸就夠了，為什么還要加醋酸鉀？做過(guò)質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)的同學(xué)應(yīng)該記得，加入溶液N3后，會(huì)出現(xiàn)大量沉淀。這些沉淀實(shí)際上是溶液2中醋酸鉀與SDS相互作用產(chǎn)生的十二烷基硫酸鉀（英文名稱十二烷基硫酸鉀，PDS）加入溶液N3后，SDS遇到鉀離子，PDS不溶于水，會(huì)很快沉淀。

那么溶液3的加入是如何去除蛋白質(zhì)基因組DNA等雜質(zhì)的呢？原因是溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)容易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸會(huì)與一個(gè)SDS分子結(jié)合，它們的結(jié)合會(huì)形成SDS2多肽復(fù)合物，使變性的蛋白質(zhì)溶解在溶液中，從而使多肽鏈更好地與基因組DNA糾纏在一起。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸酯與變性蛋白結(jié)合成復(fù)合物，十二烷基硫酸酯的沉淀會(huì)將變性蛋白一起沉淀，同時(shí)變性蛋白會(huì)與基因組DNA糾纏在一起，大部分結(jié)果是共沉淀。高離子濃度的溶液加速沉淀過(guò)程。此外，溶液中和后變性蛋白表面電荷減少，也能促進(jìn)變性蛋白的沉淀。

溶液PE（laundry bag）

成分濃度10mMTris-HCl（pH7.5），80%乙醇（Ethanol）

洗面奶的作用主要是洗去多余的鹽離子。所有的試劑盒都使用硅膠柱提取DNA。DNA吸附在硅膠柱上后，需要用洗臉盆洗去多余的鹽離子。洗衣袋含有高濃度的乙醇因?yàn)橐掖紩?huì)影響后續(xù)的消化或測(cè)序反應(yīng)，所以在洗脫DNA之前必須在離心機(jī)中”空甩”柱，完全除去乙醇。

溶液EB（Elution buffer）

成分濃度10mMTris-HCl（pH7.5）

EB的作用是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。洗脫緩沖液中不能含有過(guò)高濃度的鹽離子，因?yàn)樵诟啕}環(huán)境中，鹽陽(yáng)離子會(huì)破壞硅膠負(fù)氧自由基與水的氫鍵，使整個(gè)硅膠帶正電荷，吸引帶負(fù)電荷的DNA分子。此外，加熱的洗脫液（50°C）可以加速DNA從硅膠膜上的分離。另外，離心前在膜上長(zhǎng)時(shí)間保留EB緩沖液會(huì)更有利于DNA洗脫。

不同公司的質(zhì)粒提取試劑盒中的溶液成分可能不一樣，比如P1可以去除葡萄糖，PE溶液甚至可以直接用水代替。質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中一個(gè)基本而重要的實(shí)驗(yàn)雖然這個(gè)實(shí)驗(yàn)本身很簡(jiǎn)單，但它的原理有些復(fù)雜。邊肖認(rèn)為，知道它是什么和為什么，知道實(shí)驗(yàn)的原理，當(dāng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，就會(huì)更容易找到原因并加以糾正。